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BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA
UNICAMP

 
TESE DE DOUTORADO
 
Autor: Fernandes, João Roberto
Título: Metodologias Analíticas Enzimáticas para Análise de Oxalato em Amostras de Interesse Biológico
Ano: 1996
Orientador: Prof. Dr. Graciliano de Oliveira Neto
Coorientador: Prof. Dr. Matthieu Tubino
Departamento: Química Analítica
Palavras-chave: Oxalato oxidase, Análise por injeção em fluxo (FIA), Biossensor
Resumo: Neste trabalho foram desenvolvidas quatro metodologias enzimáticas para determinação de ácido oxálico. Em duas delas, empregou-se análise por injeção em fluxo(FIA) com reatores enzimáticos constituidos pelas enzimas oxalato oxidase, [E. C. 1.2.3.4] e peroxidase, [E. C. 1.11.1.7] imobilizadas sobre sorgo e cevada ativadas com glutaraldeído. Nas determinações por condutometria, o sistema apresentou comportamento linear na faixa de 0,05 a 0,50 mmol / L [ Y = 1,110 s.d. 0,7681 + (229,4 s.d. 3,013)X], R 0,9997 (s.d. 1,2164) para N = 5, com repetibilidade de 3,2 %(r.s.d.) considerando uma solução 0,10 mmol / L e frequência de análise de 20 amostras / hora. Este procedimento foi aplicado com sucesso a amostras de urina pelo método da adição padrão apresentando boa correlação com o kit da Sigma®. De maneira semelhante, as características do sistema FIA espectrofotométrico foram: faixa linear, 0,05 a 1,0 mmol / L [ Y = 1,427 s.d. 0,6075 + (94,81 s.d. 1,580)X]; R, 0,9995 s.d. 1,040 N=6 e repetibilidade, ~ 4%. A técnica foi utilizada em determinações de ácido oxálico solúvel contido em capins, cujos resultados, mostraram-se concordantes com os do método comercial. Nos outros procedimentos empregou-se eletrodos sensíveis a CO2 e O2. Com o primeiro, a enzima foi usada no seu micro-ambiente natural, semente de sorgo (BR303), acondicionada em cloreto de potássio e colocadas num reator tipo "stirring bar". As diferenças de potenciais apresentaram relação linear no intervalo 1,0 a 4,0 mmol / L. Pelo gráfico de Lineweaver-Burk, determinou-se a cosntante de Michaelis-Menten aparente, KM 1,5 mmol / L. As enzimas oxalato oxidase de cevada e peroxidase de rábano foram imobilizadas sobre um eletrodo seletivo a oxigênio. Este biossensor bi-enzimático respondeu linearmente, no intervalo de 0,080 a 0,70 mmol / L [ Y = 0,08753 s.d. 0,05358 + ( 7,701 s.d. 0,1473)X] , R=0,9993 s.d 0,08962 para N=6 nas condições: pH 4,00 (tampão succinato) e temperatura de 27,0°C. Os interferentes mais significativos foram: ácido L-ascórbico, L-aminoácidos, Cu e Al. Porém, até 2 minutos de reação, praticamente não houve alteração, mesmo no caso de ativação promovida pelos íons Fe. A metodologia mostrou-se promissora para determinações do analito em espinafre. Todos dispositivos enzimáticos mativeram em média 70% da atividade inicial ao fim de três meses de uso (20 análises por semana).
Abstract: Several enzymatic methodologies were developed for oxalic acid analyses. Conductimetric and spectrophotometric flow injection (FI) manifolds has been constructed with barley and sorghum oxalate oxidase, [E.C. 1.2.3.4] and horseradish peroxidase, [E. C. 1.11.1.7]. Conductimetry furnished linear range 0.05 to 0.50 mmol / L [ Y = 1.110 s.d. 0.7681 + (229.4 s.d. 3.013)X], R 0.9997 s.d. 1.216 for five analyses, repeatibility 3.2% r.s.d. for 0.10 mmol / L oxalic acid solution and an anaIysis frequency of 20 samples per hour. lt is successful procedure to analyses urine specimens showing good correlation with Sigma's kit®. ln the same way, spectrophotometric method showed: linear range, 0.05 to 1.0 mmol / L [ Y = 1.427 s.d. 0.6075 + (94.81 s.d. 1.580)X]; R, 0.9995 s.d. 1.040 and reIative standard deviation less than 4%. The FI system was applied to determine soluble oxalic acid in grasses. The CO2 and O2 gas sensing electrodes were employed to design "stirring bar reactor" and biosensor, respectively. Stirring bar reactor was filled with embebed aqueous KCI solution Sorghum vulgare, BR-303 variety seeds. Potentials variations furnished linear range 1.0 to 4.0 mmol / L. Apparent Michaelis-Menten constant, 1.5 mmol / L was obtained by Lineweaver-Burk, treatment. Bienzyme biosensor based in barley oxalate oxidase and horseradish peroxidase immobilized on O2 transducer was constructed. A linear biosensor response was observed from 0,080 to 0.70 mmol / L [ Y = 0.08753 s.d. 0.05358 + (7,701 s.d. 0.1473)X], R=0.9993 s.d. 0.08962 for six measurements, at optimal conditions: pH 4,00 (succinate buffer with 1 mmol / L EDTA dissodium salt) and 27,0°C. Until 2 minutes of the reaction time there is no influence from the interferences as, L-ascorbic acid, L-amino acids, Cu and Al, as well from the activation by Fe ions. This procedure was useful to determine soluble oxalic acid in spinach. After 3 months with 20 analyses per week alI enzymatic materials remained 70% of the initiaI activities.
Arquivo (Texto Completo): vtls000101946.pdf ( tamanho: 3,10MB )

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