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BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA
UNICAMP

 
TESE DE DOUTORADO
 
Autora: Rodrigues, Maria Silvania Marques
Título: Produção de Lipases e sua Aplicação na Eliminação de Resinas em Lignocelulósicos
Ano: 1997
Orientador: Prof. Dr. Nelson Eduardo Durán Caballero
Departamento: Fisico-Química
Palavras-chave: Madeira, enzimas
Resumo: Lipases produzidas a partir do Penicillium citrinum no Meio de Extrato de Levedura (MEL) e no Meio de Sulfato de Amônio (MSA) , mantiveram temperatura ótima de 37°C e pH entre 8,0 - 8,5, sendo que seus pH's no máximo de produção da atividade lipolítica extracelular ficou em torno de 2,2 - 3,0 (meio MSA), e 6,5 - 7,8 (meio MEL). Observou-se que ao manter-se a lipase no extrato parcialmente purificado a 6°C, não ocorreu alterações na sua atividade lipolítica após 60 dias armazenada. Através de uma hidrazinólise, transformou-se o polietilenotereftalato (dacron) da forma em filme para pó, obtendo-se dacron-hidrazida magnetizado com sucesso a partir de reações entre os íons férricos e ferrosos em pH alcalino. Lipases do Penicillium citrinum produzidas no meio MSA foram fixadas a esse suporte, dacron-hidrazida magnetizado. Os resultados mostraram que 19 mg do Extrato Parcialmente Purificado (EPP) foram imobilizados por grama de suporte após 3 horas de incubação, mostrando uma atividade específica em torno de 73% da enzima solúvel. A enzima imobilizada também manteve sua temperatura ótima em 37°C e pH em torno de 8,5. Entretanto mostrou-se mais termoestável do que a enzima solúvel, permanecendo com 60 % de sua atividade enzimática após incubada por 1 hora à 50°C. Usando p-nitrofenilpalmitato (pNPP) como substrato (37°C, pH 7,2), a enzima solúvel e imobilizada apresentou uma cinética segundo Michaelis-Menten. A lipase solúvel mostrou um Km aparente de 235 mM e Vmáx 0,99 UI/mg de proteina, enquanto a lipase imobilizada mostrou um Km de 281 mM e Vmáx 0,56 Ul/mg de proteína. Após extração com acetona, o "pitch", líquido viscoso e marrom, presente no rejeito, ficou em torno de 9%. Todos os ensaios com polpas apresentaram ácidos graxos. Entretanto, quando adicionou-se lipase, houve um aumento significativo dos ácidos graxos totais, indicando um valor de ácidos totais de 0,357 mg de ácidos graxos livres pela hidrólise enzimática. Espectros de infravermelho dos extrativos hidrofílicos e lipofílicos presentes no "pitch", indicaram que lavagens preliminares das polpas, sob agitação, principalmente com água, liberam substâncias que poderiam se acumular nos equipamentos. Como também, que não há diferenças significativas na eliminação dos ácidos graxos livres quando as polpas são lavadas com concentrações diferenciadas de NaOH. Resultados obtidos apartir dos dados GC-MS indicam que a maioria dos compostos presentes no "pitch" em estudo são hidrocarbonetos de cadeias longas e ácidos monosaturados.
Abstract: Lipases produced from Penicillium citrinum in the Yeast Extract Medium MEL and Ammonium Sulfate Medium MSA have mantained an optimum temperature of 30 °C and pH between 8,0 - 8,5. Their pH's were around 2,2 - 3,0 (MSA medium), and 6,5 - 7,8 (MEL medium) in the maximum production of extracellular lipolytic activity. It was observed that, mantaining the lipase in the extract partially purified at 6 °C, no alterations happened in its lipolytic activity after 60 days of storage. Polyethileneterephtalate ( dacron ) was transformed through hydrazinolysis, from its film its form into powder. Dacron - Hydrazide magnetized was obtained successfully from reactions between ferric and ferrous ions in alcaline pH. The Penicillium citrinum lipases produced in MSA medium were fixed to this support, dacron - hydrazide magnetized. The results shown that 19 mg semipurified extract (EPP) were immobilized per gramme of the support after 3 - hour incubation, showing a specific activity around 73 % of the soluble enzyme. The immobilized enzyme also mantained its optimum temperature at 37 °C and optimum pH at 8,5. However, it showed itself more thermostable than the soluble enzyme, keeping 60 % of its enzymatic activity after being incubed for 1 hour at 50 °C. Using p-nitrophenylpalmitate (pNPP) as substrate ( 37 °C, pH 7,2 ), the soluble and immobilized enzyme showed a Michaelis - Menten behaviour. The soluble lipase showed an apparent Km of 235 mM and Vmáx 0,991 IU/mg of protein, while the immobilized lipase showed a Km of 281 mM and Vmáx 0,56 IU/mg of protein. After extraction with acetone, the "pitch", a viscous and brown liquid, present in the reject, was around 9 %. All tests with pulps showed free fatty acids. However, when lipase added, there was a significant increase of total fatty acids, indicating a value of 0,357 mM of free fatty acids through enzymatic hydrolysis. Infrared spectrum from hidrophilic and lipophilic extractives present in the "pitch", have indicated that preliminary pulp washes, under agitation, liberate substances which could accumulate in the equipments. Also, there are no significant differences in the elimination of free fatty acids, when the pulps are washed with different concentrations of NaOH. Results obtained from the GC data have indicated that the majority of the compounds present in the "pitch" in study, are hydrocarbons of long chains and monosaturated acids.
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