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BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA
UNICAMP

 
TESE DE DOUTORADO
 
Autora: Rodrigues, Tereza Cristina
Título: Desenvolvimento de Métodos Enzimáticos em Fluxo para a Determinação Quantitativa de Acetilcolina e de Paraoxon
Ano: 1998
Orientador: Prof. Dr. Matthieu Tubino
Departamento: Química Analítica
Palavras-chave: Colinesterase, Pesticida
Resumo: Neste trabalho, foi desenvolvido um sistema de injeção em fluxo para determinação quantitativa de acetilcolina. O método é baseado na geração de ácido acético pela reação da enzima (acetilcolinesterase) com o substrato (acetilcolina). Esta enzima foi quimicamente imobilizada em "glass beads". O ácido acético formado pela reação da colinesterase com acetilcolina permeia através de uma membrana de poli-tetrafluoretileno (PTFE) para um fluxo de água deionizada, e é detectado em uma célula condutimétrica. A relação entre a altura de pico e concentração de ácido acético formado é proporcional à concentração de acetilcolina presente na amostra, na faixa de concentração proposta. Foi encontrada uma faixa linear de 1,0x10 mol.L a 1,0x10 mol.L de acetilcolina versus altura de pico. Neste trabalho também foi desenvolvido um sistema FIA condutimétrico para detecção quantitativa do dietil p-nitrofenil fosfato (paraoxon), pesticida amplamente utilizado na agricultura. Com a introdução de uma concentração conhecida de paraoxon no sistema FIA, foi observado um decréscimo da altura do pico, como função direta de um decréscimo da quantidade de ácido acético formado, devido à inibição da colinesterase. A correlação entre a diferença de pico versus concentração de paraoxon, é linear na faixa de 1,0x10 mol.L a 5,0x10 mol.L, portanto, o limite quantitativo de detecção foi cerca de 1,0x10 mol.L de paraoxon. Para propostas semi-quantitativas, o limite de detecção pode ser considerado cerca de 5,0x10 mol.L para o paraoxon. O desvio padrão relativo obtido foi de 2,2%(n=8), para uma solução de acetilcolina 1,0x10 mol.L e uma solução de 5,0x10 mol.L de paraoxon. Para a reativação da enzima imobilizada, foram utilizadas soluções de 1,1'-trimetileno-bis(brometo de 4-formilpiridina) dioxima (TMB-4). O sistema "stopped-flow" foi estudado de forma a obter uma maior capacidade de inibição da colinesterase. A correlação entre a diferença de altura de pico versus concentração de paraoxon é linear na faixa de 1,0x10 mol.L a 5,0x10 mol.L. O sistema apresentou um limite de detecção de 5,0x10 mol.L para o pesticida. O desvio padrão relativo foi de 1,2% (n=6), para uma solução de acetilcolina 1,0x10 mol.L e uma solução de 4,0x10 mol.L de paraoxon. Também foi desenvolvido um método de determinação quantitativa para acetilcolina e para o paraoxon com detecção espectrofotométrica. Nesta caso, o ácido acético formado permeia através da membrana PTFE e é recebido por um fluxo de uma solução de púrpura de bromocresol (PBC) e é detectado espectrofotometricamente. Foi encontrado uma linearidade entre concentração de acetilcolina e altura de pico na faixa de 1,0x10 a 5,0x10 mol.L. O procedimento proposto apresentou um limite de detecção de 1,0x10 mol.L para o paraoxon, a correlação entre altura de pico e concentração de paraoxon foi de 5,0x10 mol.L a 5,0x10 mol.L, com um desvio padrão relativo de 1,7% (n=10) para uma solução de acetilcolina 5,0x10 mol.L e uma solução de 5,0x10 mol.L de paraoxon.
Abstract: In this work, a flow injection system for quantitative determination of acetylcholine was developed. The method is based on the generation of acetic acid by the reaction of acetylcholine with the enzyme cholinesterase. This enzyme was chemically immobilized on "CPG". The acetic acid formed by the enzyme (actylcholinesterase) reaction with the substrate (acetylcholine) permeates through a poly-(tetrafuoroethylene) (PTFE) membrane into a de-ionized water stream, and is detected conductimetrically in a flow-through cell. The relationship between the signal height and acetic acid concentration formed is proportional to the acetylcholine concentration present in the sample, in the purposed concentration range. A system conductimetric was developed for quantitative diethyl p-nitrophenyl phosphate (paraoxon) determinations, a pesticide of widespread used in agriculture. Introducing into the system a given concentration of paraoxon solution and observing the decrease of the reaction product as a decrease in the signal height, as a result of the decrease in the quantity of acetic acid formed, by inhibition of immobilized cholinesterase. The correlation between the peak height, for a given acetylcholine concentration, is linear from 1.0x10 to 5.0x10 mol.L of paraoxon, therefore the quantitative limit of detection was about 1.0x10 mol.L of paraoxon. ..For semi-quantitative purposes a limit of about 1.0x10 mol L can be considered. The relative estimated standard deviation (R.S.D) obtained using a 1.0x10 mol.L acetylcholine solution and a 5.0x10 mol.L paraoxon solution was 2.2% (n=8). For reactivating of the immobilized enzyme, 1,1'-trimethylene-bis( 4-formylpyridinium bromide) dioxime (TMB-4) was used. For higher a quantitative limit of detection, a stopped-flow system was used. The correlation between the peak height, and conductimetric signal is linear from 1.0x10 mol.L a 5.0x10 mol.L of paraoxon; therefore, the quantitative limit of detection was 5.0x10 mol.L for the pesticide. The R.S.D. was 1.2% (n=6), obtained using a 1.0x10 mol.L acetylcholine solution and a 4.0x10 mol.L paraoxon solution. A method was developed using spectrophotometric quantitative determination for both acetylcholine and paraoxon. The acetic acid formed by the reaction of acetylcholine and cholinesterase permeates through a PTFE membrane and is received by a stream of bromocresol purple (BCP) and is detected spectrofotometrically. Linearity for acetylcholine concentration and spectrofotometric response with a useful range from 1.0x10 to 5.0x10 mol.L of acetylcholine was observed. The proposed procedure has a quantitative limit of detection of about 1.0x10 mol.L of paraoxon, a linear range calibration of 5.0x10 to 5.0x10 mol.L, and a R.S.D. of 1.7% (n=10) at 5.0x10 mol.L paraoxon solution with a 5.0x10 mol. L acetylcholine solution.
Arquivo (Texto Completo): vtls000135494.pdf ( tamanho: 5,84MB )

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