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BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA
UNICAMP

 
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
 
Autora: Lopes, Aline Soriano
Título: Extração e Fracionamento de Proteínas de Plasma Sanguíneo Baseada no Procedimento do Ponto Nuvem
Ano: 2005
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
Departamento: Química Analítica
Palavras-chave: Proteína, Plasma, Fracionamento, Ponto nuvem
Resumo: Esta dissertação visa fracionar proteínas do plasma sanguíneo humano empregando a separação de fases por meio da formação de micelas utilizando o Triton X-114 como surfactante e NaCI como eletrólito. São avaliadas as principais variáveis responsáveis pela separação de fases: concentração do Triton X-114 (2 - 15% m/v), volume de amostra (50 - 2000 mL), concentração de NaCI (6 - 12% m/v), tempo de contato entre as proteínas e os agregados micelares (0 - 30 min) e pH (6,4 - 7,4). As proteínas totais presentes nas fases rica e pobre em surfactante são quantificadas pelo método de Bradford. Anteriormente a quantificação, é realizada a remoção do surfactante da fase rica utilizando acetona resfriada. Neste procedimento, as proteínas precipitam e o surfactante é extraído para a fase orgânica. A separação de fases é realizada a temperatura ambiente (25°C) e as variáveis otimizadas foram: 5% (m/v) de Triton X-114, 100 mL de amostra, 10% (m/v) de NaCI, tempo de contato quase instantâneo e pH 6,8. A caracterização das proteínas é realizada por meio da eletroforese 1D. O software Gel-Pro Analyzer 3.1 é utilizado para analisar as bandas e o banco de dados de proteínas Expasy é utilizado para identificar as possíveis frações protéicas. Duas bandas com concentrações mensuráveis são observadas por SDS-PAGE na fase rica em surfactante. Uma delas pode ser atribuída à albumina, proteína de alta concentração no plasma sanguíneo, e a outra banda a uma apolipoproteína D ou a uma cadeia leve de imunoglobulina. Um padrão de albumina do soro bovino é utilizado como referência para apontar possíveis mudanças na estrutura secundária por dicroísmo circular. Por meio do resultado observam-se mudanças na conformação da albumina quando esta é submetida à separação de fases com Triton X-114.
Abstract: The goal of the present work is to fractionate the human blood plasma proteins using micelle-mediated phase separation with Triton X -114 as surfactant and NaCI as electrolyte. Some parameters that affect the phase separation are evaluated, such as Triton X-114 concentration (2 - 15% w/v), sample volume (50 - 2000 mL), NaCI concentration (6 - 12% w/v), contact time between proteins and micelles aggregation (0 - 30 min) and pH (6.4 - 7.4). The total proteins are quantified in both surfactant-rich and -poor phases by using the Bradford method. The surfactant present in the rich phase is removed with ice-cold acetone before the protein determination, in which the proteins are precipitated and the surfactant is removed to the organic phase. The separation is carried out at room temperature (25 °C) and the optimized parameters were 5% (w/v) Triton X-114, 100 mL of sample volume, 10% (w/v) NaCI, contact time almost instantaneous and pH as 6.8. Protein characterization is made through 1D electrophoresis. The software Gel-Pro Analyzer 3.1 is used for analyzing the bands as well as the protein data bank Expasy is used for identifies the possible protein fractions. Two bands are observed in the surfactant-rich phase with measurable concentrations. One of them may be attributed to albumin, which is present at highest concentration in blood plasma, and the other one may be attributed to apolipoprotein D or immunoglobulin light chain. Bovine serum albumin standard is used as reference for emphasizing possible changes on the secondary structure of proteins by circular dichroism. Changes were observed in the albumin conformation when the protein is submitted to phase separation with Triton X-114.
Arquivo (Texto Completo): vtls000365966.pdf ( tamanho: 3,41MB )

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