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BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA
UNICAMP

 
TESE DE DOUTORADO
 
Autor: Chen, Lu Shi
Título: Triagem de Alto Desempenho na Detecção de Atividade de Epóxido-Hidrolases e Monooxigenases Utilizando Células Íntegras
Ano: 2006
Orientadora: Profa. Dra. Anita Jocelyne Marsaioli
Departamento: Química Orgânica
Palavras-chave: Triagem de alto desempenho, Epóxido-hidrolases, Monooxigenases, Biodiversidade
Resumo: A biocatálise é uma área multidisciplinar de pesquisa, na qual as novas tecnologias têm sido desenvolvidas rapidamente a fim de oferecer opções e soluções únicas aos diversos desafios encontrados em síntese orgânica, atuando em complemento com a química sintética tradicional. Frente à necessidade de acompanhar o progresso desta área, este trabalho visa à implementação de metodologias de triagens de alto desempenho (HTS) que permitam a detecção do potencial enzimático microbiano de uma forma simples e rápida. Este trabalho está dividido em dois tópicos principais: epóxido-hidrolases (EH) e monooxigenases (MO). Cada um dos tópicos relatará a síntese das sondas fluorogênicas que foram utilizadas nos testes de HTS e, em seguida, encontrar-se-á os resultados de avaliações preliminares destas sondas com diferentes concentrações celulares e de reagentes. As melhores condições para os testes com células microbianas foram encontradas e empregadas para avaliar diferentes microrganismos provenientes do bioma brasileiro ou de coleções de cultura brasileiras. Os resultados obtidos com as sondas fluorogênicas foram comparados com os relatados na literatura ou os obtidos no nosso laboratório. No tópico de EH, foram empregadas, ainda, sondas quirais que permitiram a determinação de velocidades iniciais e excessos enantioméricos das reações. Foi realizada a adaptação do teste de adrenalina para detecção de EH nos microrganismos utilizando 23 substratos comerciais, associando o potencial dos ensaios de HTS com substratos de interesse. Por último, foram realizadas reações de biotransformações via biocatálise convencional de microrganismos que apresentaram resultados mais interessantes nos ensaios de fluorescência. Por meio destas biotransformações, foi possível detectar processo de estereoinversão do 1,2-octanodiol catalisado por A. niger CCT 1435 com >80% de rendimento e 90% ee e processos de resolução cinética catalisados por B. pumilus CBMAI 0008, CBC 008 e CBC 009 e A. niger CCT 4846. A diferenciação do tipo de MO (Baeyer-Villiger monooxigenase e hidroxilase) detectadas em T. cutaneum CCT 1903, R. oryzae CCT 4964, AMA 7 e o fungo CCT 5632 foi também obtida por biocatálise convencional.
Abstract: Biocatalysis is a multidisciplinary area, where new technologies are developing rapidly in order to offer unique options and solutions to different organic chemistry problems, complementing the classical synthetic chemistry. Facing the need imposed by progress in this area, this project aims at the implementation of high-throughput screening (HTS) methodologies allowing an easy and direct method to detect enzymatic activity using whole cells. This thesis is divided in two main topics: epoxide hydrolases (EH) and monooxygenases (MO). Each topic will report the synthesis of the fluorogenic probes used in the HTS assays and their application in preliminary evaluations with different cellular concentrations and reagents. The best experimental conditions with microbial cells were found and employed to evaluate microorganisms from Brazilian culture collections or isolated from national biomes. The fluorogenic assay results were compared with those in the literature or those obtained in our laboratory. In the EH topic, chiral probes were used, which allowed the initial velocity measurements and enantiomeric excess calculations. Additionally, the adrenaline test was applied to the epoxide hydrolases detection in microorganisms using 23 commercials substrates. This methodology associates the potential of the HTS assays with substrates of interest. Finally, the HTS outstanding results were better investigated by conventional catalysis. Therefore, using this approach we were able to provide evidences of the stereoinversion process of 1,2-octanediol catalyzed by A. niger CCT 1435 (yield > 80% with 90% ee), and the kinetic resolution of 1,2-octanediol by B. pumilus CBMAI 0008, CBC 008, CBC 009 and A. niger CCT 4846. The differentiation between the monooxigenases (Baeyer-Villiger monooxygenase and hydroxilase) detected in T. cutaneum CCT 1903, R. oryzae CCT 4964, AMA 7 and the fungus CCT 5632 was also provided by conventional biocatalysis.
Arquivo (Texto Completo): vtls000383859.pdf ( tamanho: 1,73MB )

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