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BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA
UNICAMP

 
TESE DE DOUTORADO
 
Autora: Garcia, Jerusa Simone
Título: Avaliação do Desenvolvimento de Girassol por Meio de Análises de Proteínas e Metaloproteínas
Ano: 2006
Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda
Departamento: Química Analítica
Palavras-chave: Girassol, Proteína, Metaloproteína, Contaminação
Resumo: Este trabalho de Tese apresenta os resultados referentes ao crescimento e ao desenvolvimento da cultura de girassol (Helianthus annuus L.) submetida a 7 tratamentos e as suas inter-relações com as análises de proteínas e metaloproteínas. Em quatro tratamentos, foram adicionadas soluções de íons metálicos (Cd, Cu, Pb e Zn) ao substrato. Em outros dois tratamentos, usados como testemunhos, foi empregada somente água desionizada para a irrigação das plantas. No último tratamento foi acrescentada uma solução denominada mista, contendo simultaneamente os 4 contaminantes. Nos tratamentos foi avaliada a altura das plantas, a biomassa produzida e a distribuição e translocação de nutrientes do substrato para as partes do girassol. As plantas submetidas à contaminação com a solução mista foram as mais afetadas em termos fisiológicos. Também foi investigada a influência das espécies metálicas na composição protéica. Para isso, foi feita a extração das proteínas presentes no sistema foliar, caulinar e radicular dos girassóis, sendo, em seguida, determinada a concentração das proteínas totais. As proteínas das folhas foram ainda separadas utilizando a eletroforese do tipo SDS-PAGE. Este processo possibilitou identificar, em termos de massa molar, o conjunto de proteínas presentes em cada tratamento. As proteínas das folhas procedentes da contaminação com zinco foram as mais prejudicadas, ocorrendo uma diminuição acentuada de suas expressões e a supressão de algumas delas. Este fato ocorreu devido à geração excessiva de espécies de oxigênio reativas, conduzindo a um estresse oxidativo. Tal evento foi confirmado pela análise da atividade enzimática da catalase, superóxido dismutase e glutationa redutase. Com a finalidade de se fazer uma investigação mais detalhada, as proteínas das folhas foram separadas também por eletroforese bidimensional, sendo detectadas cerca de 260 proteínas. Além disso, foi confirmado que as proteínas das plantas contaminadas com zinco foram as mais comprometidas, sendo algumas delas sequer detectadas. Em uma outra vertente da Tese foram estabelecidos quais íons metálicos estavam efetivamente ligados as proteínas. Para isso, foi executado, por meio de fluorescência de raios-X com radiação Síncrotron, o mapeamento de 43 bandas obtidas da separação SDS-PAGE. Em seguida, as intensidades de 11 espécies químicas foram avaliadas por intermédio da ferramenta quimiométrica rede Neural Kohonen. Esta ferramenta selecionou seis amostras com potencial para o prosseguimento das investigações. Nestas amostras foi feita a avaliação quantitativa dos íons metálicos presentes nas estruturas das proteínas. Para isso, as bandas foram decompostas por dois sistemas diferentes (combustão assistida por microondas e forno de microondas à alta pressão), sendo possível investigar a correlação entre a formação e/ou preservação das metaloproteínas e o meio de cultura de onde elas se originavam. As proteínas procedentes dos girassóis desenvolvidos sem contaminação apresentaram níveis maiores de íons metálicos. Assim sendo, importantes metaloproteínas e enzimas participaram de processos metabólicos para combater os efeitos adversos provocados pelo excesso de íons metálicos, principalmente o zinco.
Abstract: This work describes an evaluation of sunflower (Helianthus annuus L.) growth when it is submitted to seven treatments, and their interrelation with proteins and metalloproteins analyses. Metal ion solutions (Cd, Cu, Pb and Zn) were added to the substrate in four treatments. In another two, used as controls, the plants were irrigated only with deionized water. Finally, in the seventh treatment, a solution called "mixed ions solution", simultaneously containing the four metal ions was used. The sunflower height, biomass production and nutrient distribution and translocation were evaluated. Sunflower plants contaminated with mixed solution are more affected in terms of physiological parameters. The influence of metal species on the protein composition was also investigated. For that, the extraction of sunflower proteins present in leaves, stem and root tissue was carried out. The total protein content in all extracts was determined according to the Bradford method. The leaves proteins were separated using SDS-PAGE electrophoresis. Leaves from plants irrigated with zinc were more affected in terms of protein expression. In such case, there was a significant decrease of protein amounts and the suppression of some of them. This is explained by the excessive generation of reactive oxygen species that induced an oxidative stress, which was confirmed by the enzymatic activity analyses of catalase, superoxide dismutase and glutathione reductase. In order to obtain more details about the changes in protein composition, leaf proteins were also separated using two-dimensional electrophoresis. In this analysis it was possible to detect about 260 protein spots and confirm that the proteins of plants contaminated with zinc were more affected. In another part of this work, the identification of the metal ions bound to the proteins was carried out. For that, 43 protein bands obtained from SDS-PAGE separation were mapped using synchrotron radiation X-ray fluorescence analysis. The fluorescence intensities of 11 chemical species were evaluated by the Kohonen Neural Network. This chemometric tool selected six samples in which the quantitative analysis of metal ions are made. For that, the bands were decomposed by two different systems (microwave-assisted sample combustion and focused microwave oven). In these samples, the correlation between the formation and/or preservation of metalloproteins and the substrate were investigated. The proteins proceeding from sunflowers plants without contamination showed high metal ions levels so that it is possible to conclude that important metalloproteins and enzymes participate in metabolic processes to avoid the adverse effects provoked by metal ion excess, particularly when zinc is considered.
Arquivo (Texto Completo): vtls000393240.pdf ( tamanho: 2,66MB )

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