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BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA
UNICAMP

 
TESE DE DOUTORADO
 
Autor: Iglesias, Amadeu Hoshi
Título: Utilização de Espectrometria de Massas, Ligação Cruzada (Cross-Linking) e Footprinting no Estudo de Interações Proteína-Proteína
Ano: 2009
Orientador: Prof. Dr. Fábio Cesar Gozzo
Departamento: Química Orgânica
Palavras-chave: Espectrometria de massas, Cross-Linking, Footprinting, Interações proteína-proteína
Resumo: A Espectrometria de Massas (MS) é hoje a principal técnica de caracterização de estrutura primária de proteínas devido às vantagens intrínsecas da técnica. As técnicas de cross-linking e footprinting visam desfrutar de tais vantagens para obtenção de informações estruturais de complexos protéicos. Nesse projeto foram realizados estudos de fragmentação de peptídeos contendo como cross-linker o DSS, reagente mais utilizado para esse propósito. Os mecanismos de fragmentação foram propostos baseados na dissociação de peptídeos modelos sintetizados para gerar espécies que mimetizassem experimentos com proteínas. Esses estudos permitiram a identificação de íons marcadores, que foram posteriormente utilizados em experimentos de Varredura de Íons Precursores para auxiliar na detecção de peptídeos modificados. Para realização dos experimentos de footprinting, foi desenvolvida uma linha de luz no LNLS. Posteriormente, foi proposto um novo método de quantificação de cinética de oxidação baseado nos dados de LC-MS, levando em consideração todos os produtos de oxidação formados. Esses métodos foram utilizados no estudo de interação das proteínas Tif34 e Tif35 do fator de iniciação de tradução de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos indicam que Tif34 apresenta dois possíveis sítios de interação para a proteína Tif35.
Abstract: Mass Spectrometry (MS) is the most important tool for analyses related to protein primary structure. Cross-Linking and footprinting aim to bring those advantages to gain insights in the spatial structure of protein complexes. In this work the fragmentation of peptides containing DSS, the most used cross-linker, was studied. Fragmentation mechanisms were proposed based on the dissociation of model peptides which were synthesized in order to generate species that would resemble species found in experiments with proteins. Diagnostic ions were identified which allowed the use of Precursor Ion Scan to detect those species. In order to perform footprinting experiments, a new beamline was developed at the LNLS. A new method for quantitation of oxidation kinetics was developed based on LC-MS analysis, which considers every single oxidation product that can be generated. Those methods were thereafter used in the study of the interaction between Tif34 and Tif35, proteins which compose a translation initiation factor of Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Tif34 presents two different sites for the interaction with Tif35.
Arquivo (Texto Completo): 000446395.pdf ( tamanho: 7,71 MB )

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