Comissão
Estatuto
Histórico
Localização
Contato
BIQ
BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA
UNICAMP

 
TESE DE DOUTORADO
 
Autor: Mantovani, Simone Moraes
Título: Triagem, Aplicação e Engenharia de Biocatalisadores para Transformações Enantio e Regiosseletivas
Ano: 2011
Orientador: Profa. Dra. Anita Jocelyne Marsaioli
Departamento: Química Orgânica
Palavras-chave: Biocatálise, Metagenômica, Desracemização, Evolução dirigida
Resumo: A utilização de biocatalisadores em processos industriais permite a obtenção de produtos de alto valor agregado em sintonia com as demandas de caráter tecnológico e de preservação ambiental. De maneira geral, o desenvolvimento de um biocatalisador envolve inicialmente a triagem da atividade de interesse, seguida da análise das propriedades como seletividade (regio e estereosseletividade) ou estabilidade, que podem ser posteriormente otimizadas por evolução dirigida ou desenho racional até a obtenção de um biocatalisador ótimo. Dessa maneira, os objetivos desse trabalho de tese foram aplicar diferentes metodologias para obtenção de biocatalisadores eficientes, que serão descritos em três capítulos. No capítulo I foi descrita a exploração de novos biocatalisadores por triagem da atividade enzimática em formato miniaturizado de biblioteca metagenômica composta por 864 clones utilizando sondas fluorogênicas, e que levou à detecção de quatro clones ativos para a hidrólise de ésteres. Posteriormente esses clones foram avaliados frente a substratos não modificados permitindo identificar um clone expressando uma enzima de alta quimio e enantiosseletividade para resolução cinética de éster propiônico (E > 100).. No capítulo II foi descrito o mecanismo da desracemização de álcoois secundários por células íntegras de Candida albicans CCT 0776 que consiste em um processo cíclico de oxidação e redução. A primeira etapa é catalisada por uma enzima altamente (S)-seletiva dependente de NADP e O2, seguida de redução pouco seletiva dependente de NADH. Esse sistema foi aplicado para diferentes álcoois e dióis, e possibilitou a detecção dos enantiômeros anti-Prelog com conversões de moderadas a altas (60 a 99 %) e altos excessos enantioméricos (80 a 90%) entre períodos de 20 a 120 h. Por fim, no Capítulo III foi descrito o trabalho de engenharia do citocromo P450Bm3 por exploração combinatória de alanina e posterior evolução dirigida para desmetilação regiosseletiva de substratos volumosos. Essa etapa foi desenvolvida durante o estágio de doutorando em Catech (EUA) sob a supervisão da Profa. Frances Arnold e permitiu a obtenção de variantes capazes de catalisar N-desmetilação de alcalóides e hidroxilação de esteróides com rendimentos moderados (20-80%). Todos esses resultados mostram a variedade de técnicas que podem ser empregadas para o desenvolvimento e aplicações de biocatalisadores visando transformações regio e estereosseletivas eficientes.
Abstract: Biocatalysts have been widely applied in recent decades for industrial processes yielding high value products under environmentally friendly reaction conditions. The development of biocatalysts often begins with screening to identify enzymes with suitable activities followed by characterization of the enzymes chemo-, regio- and stereoselectivity or stability. However, identification of new biocatalysts does not always yield enzymes suitable for a given synthetic problem. To overcome this limitation, biocatalysts can be optimized by protein engineering using rational design or directed evolution. In this context, this thesis describes different methodologies that can be explored to obtain efficient biocatalysts for selective transformations. In Chapter I, functional screening of an 864 member metagenomic library derived from soil using a miniaturized assay based on fluorogenic substrates is described. These assays identified four clones capable of ester hydrolysis. Upon further evaluation using high value substrates, one clone, B6, was shown to display high chemo- and enantioselectivity (E>100) for propionic ester hydrolysis. Chapter II describes the study and application of secondary alcohols deracemization using Candida albicans CCT 0776 whole cells. Monitoring the reaction using phenylethanol as a substrate revealed this system furnishes the (R)-enantiomer in high yield and enantiomeric excess mediated by a cyclic process of oxidation and reduction. In summary the first step is catalyzed by a high S- selective enzyme dependent on NADP and O2 followed by a non-selective reduction catalyzed by an NADH-dependent enzyme. This whole cell biocatalyst was applied to different sec-alcohols and diols allowing the detection of the anti-Prelog products in moderate to high conversions (60 and 99%) and high enantiomeric excess (80 and 90%) within 20 to 120 hour incubation times. Finally, in Charpter III the engineering of cytochrome P450Bm3 by alanine combinatorial scanning mutagenesis followed by directed evolution was used to identify enzymes with regioselective demethylation of bulky substrates. These libraries furnished variants capable of catalyzing regioselective N-demethylation of alkaloids and diastereoselective hydroxylation of steroids in moderate yields. Taken together these studies show the variety of techniques that can be applied for development and application of biocatalysts enabling selective and efficient transformations.
Arquivo (Texto Completo): 000827683.pdf (tamanho: 4,34MB)

Instituto de Química / Caixa Postal n° 6154
Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
13083 - 970, Campinas, SP, Brasil
e-mail: biq@iqm.unicamp.br
© 2012-2014 BIQ