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BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QUÍMICA
UNICAMP

 
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
 
Autora: Rampasio, Raquel Rodrigues
Título: Estudos sobre a Clonagem e Expressão do Gene SEH1 (Epóxido Hidrolase) de Pichia stipitis em Pichia pastoris
Ano: 2012
Orientadora: Profa. Dra. Luciana Gonzaga de Oliveira
Departamento: Química Orgânica
Palavras-chave: Epóxido hidrolase, Pichia stipitis, Pichia pastoris, Expressão heteróloga
Resumo: Epóxidos enantiopuros e dióis vicinais têm sido utilizados na síntese de inúeras moléculas bioativas. Dessa forma, as epóxido-hidrolases microbianas capazes de hidrolisar enantioseletivamente epóxidos racêmicos emergiram como uma alternativa promissora na obtenção destes compostos. Recentemente, a linhagem P. stipitis CCT 2617 foi selecionada por apresentar atividade hidrolítica frente a epóxidos terminais e teve seu genoma completo publicado. Assim, esta levedura foi selecionada para o trabalho de clonagem e expressão de sua epóxido hidrolase. Neste trabalho, a clonagem do gene SEH1, que codifica para a epóxido hidrolase de P. stipitis, foi efetuada com sucesso em P. pastoris, tanto no vetor pPICZa A, quanto no vetor pPICZ B. A clonagem da proteína com a cauda de histidina deve auxiliar na detecção da expressão. A detecção de uma banda, referente a uma proteína de 46 kDa, no gel de eletroforese foi um indício de que a expressão da enzima SEH (contendo o fator a) ocorreu, porém, não conseguimos reproduzir este resultado posteriormente. Além disso, buscamos melhores alternativas para a detecção da atividade enzimática, como o teste de adrenalina e o ensaio baseado em substrato fluorogênico, que devem ser aperfeiçoados para a utilização com células íntegras. A modelagem computacional da estrutura tridimensional da PSEH resultou em um modelo contendo 40% de hélices a e 12% de folhas b. Determinamos que os resíduos que devem fazer parte do sítio ativo são Tyr319, Asp209, Asp352 e His383 e, tendo em vista que a PSEH deve se apresentar na forma de um homodímero com sítio ativo similar ao das EHs de P. aeruginosa, A. radiobacter e A. niger, nossa hipótese é que esta enzima deve hidrolisar epóxidos pouco volumosos e aromáticos com algum nível de enantiosseletividade.
Abstract: Enantiopure epoxides and vicinal diols have been used to prepare a number of bioactive molecules. Thus, the microbial epoxide hydrolases able to enantioselectivity hydrolyze racemic epoxides emerged as a promising alternative in the synthesis of these compounds. Recently, the P. stipitis CCT2617 strain was selected due to the presence of hydrolytic activity against terminal epoxides and had its genome completely described. Therefore, this yeast was selected for cloning and expression of the gene SEH1, which was annoted as epoxide hydrolase. In this work, the cloning of SEH1 gene, codifying for the epoxide hydrolase of P. stipitis, was done with success in P. pastoris, both in pPICZa A and pPICZ B vectors. The cloning of the protein with a histidine tag should help in the detection of expression. The detection of a protein with 46 kDa evidenced that the expression of SEH enzyme (containing the a factor) is occurring, however, this result was not reproducible due to the sample degradation. Furthermore, better alternatives for the detection of enzyme activity were performed, as adrenaline test and fluorogenic assay, which must be optimized for application with whole cells. The 3D structure computational modeling of PSEH resulted in a model that contains 40% of a helices and 12% of b sheets. Our hypothesis is that the residues that make part of the active site are Tyr319, Asp209, Asp352 and His 383. And, considering that the PSEH should be in the homodimeric form with an active site similar to that of the EHs of P. aeruginosa, A. radiobacter and A. niger, this enzyme should hydrolyze small and aromatic epoxides probably with some enantioselectivity.
Arquivo (Texto Completo): 000904288.pdf ( tamanho: 1,95MB )

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